蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印具體步驟

    蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印，也就是WesternBlot實(shí)驗(yàn)里的“轉(zhuǎn)膜"步驟，是把凝膠上已經(jīng)分離的蛋白質(zhì)，在電場作用下轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)進(jìn)行抗體孵育和檢測。

    這個(gè)過程的標(biāo)準(zhǔn)操作方法主要有三種：濕法轉(zhuǎn)印、半干法轉(zhuǎn)印和快速轉(zhuǎn)印。雖然它們的儀器和耗時(shí)不同，但核心步驟都包括制作“三明治"結(jié)構(gòu)（凝膠-膜組合）、施加電場和轉(zhuǎn)印后的處理。以下是各種方法的具體操作步驟：

一、通用步驟：從電泳到轉(zhuǎn)印前準(zhǔn)備

    無論用哪種轉(zhuǎn)印方法，開始前的準(zhǔn)備工作是共通的。

    凝膠準(zhǔn)備：電泳結(jié)束后，小心撬開玻璃板，切除濃縮膠和多余的分離膠，在轉(zhuǎn)膜液中平衡5-10分鐘。

    膜的準(zhǔn)備：根據(jù)蛋白分子量選擇0.22μm或0.45μm的膜。如果是PVDF膜，需要先在甲醇中浸泡活化，再轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)膜液中平衡；如果是NC膜，直接在轉(zhuǎn)膜液中平衡即可。

二、濕法轉(zhuǎn)印具體步驟

    這種方法是將整個(gè)“三明治"浸沒在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，散熱好，轉(zhuǎn)膜效果穩(wěn)定。

    浸泡耗材：將海綿墊和濾紙浸入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中，充分潤濕。

    制作“三明治"：打開轉(zhuǎn)印夾，按順序從負(fù)極（黑色）到正極（透明/白色）依次放上海綿、濾紙、凝膠、膜、濾紙、海綿?？梢杂貌ＡО糨p輕滾動(dòng)趕走各層之間的氣泡。

    放入電轉(zhuǎn)槽：將夾子正確放入轉(zhuǎn)移槽，倒入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液，放入冰盒，蓋上蓋子，再將整個(gè)電轉(zhuǎn)槽放在冰浴里。

    設(shè)置電源與轉(zhuǎn)?。哼B接電源，通常以100-110V恒壓轉(zhuǎn)印60-90分鐘，或200mA恒流轉(zhuǎn)印1-2小時(shí)。大分子蛋白（>150kDa）可以適當(dāng)延長時(shí)間。

三、半干法轉(zhuǎn)印具體步驟（快速省試劑）

    這種方法不需要將“三明治"浸沒，直接用浸滿轉(zhuǎn)膜液的厚濾紙作為離子源，速度快，試劑用量少。

    平衡凝膠與膜：凝膠在轉(zhuǎn)膜液中平衡5-10分鐘，膜按上述方法處理。

    制作“三明治"：在水平陽極板上，從下到上依次放上濾紙、膜、凝膠、濾紙，每一層都要趕盡氣泡。

    啟動(dòng)轉(zhuǎn)?。荷w上陰極板和安全蓋，連接電源。常用電壓為10-15V，轉(zhuǎn)印15-45分鐘。

四、快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)具體步驟（分鐘級轉(zhuǎn)印）

    這是近年發(fā)展的技術(shù)，以Bio-Rad的Trans-BlotTurbo為代表，使用專用的預(yù)裝耗材和高電流，在3-10分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)印。

    準(zhǔn)備轉(zhuǎn)印包：根據(jù)凝膠尺寸選擇一次性或半干轉(zhuǎn)印包。按說明書指示打開包裝，鋪好含緩沖液的底層。

    制作“三明治"：將平衡后的凝膠放在轉(zhuǎn)印包底層上，覆蓋膜，再用滾輪趕盡氣泡。蓋上預(yù)濕的頂層（含緩沖液的濾紙），形成一個(gè)完整的“三明治"結(jié)構(gòu)。

    放入儀器并運(yùn)行：將“三明治"放入儀器中，根據(jù)系統(tǒng)提示選擇預(yù)設(shè)程序，啟動(dòng)轉(zhuǎn)印。系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)完成整個(gè)過程。

五、轉(zhuǎn)印完成后的操作

    無論用哪種方法，轉(zhuǎn)印結(jié)束后都需要進(jìn)行以下幾步：

    檢查轉(zhuǎn)印效果：取出膜，觀察預(yù)染蛋白Marker的條帶是否清晰。如果需要，可以用麗春紅染液對膜染色，觀察全部蛋白條帶。

    封閉：將膜放入5%脫脂牛奶或BSA溶液中，室溫下緩慢搖晃封閉1小時(shí)，或在4°C下封閉過夜。

    后續(xù)步驟：封閉完成后，就可以進(jìn)行一抗孵育、二抗孵育和化學(xué)發(fā)光檢測等后續(xù)操作了。

總結(jié)

    追求穩(wěn)定通用，尤其是大分子蛋白：選濕法轉(zhuǎn)印，時(shí)間留足1-2小時(shí)。

    中小蛋白，想快速出結(jié)果：選半干法，操作快，省試劑。

    追求標(biāo)準(zhǔn)化、高效率：選快速轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，幾分鐘就完成。

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